本发明名为一种新的转基因黑曲霉检测试剂盒及其检测方法，涉及转基因微生物检测技术领域，本发明通过巧妙地设计针对转基因黑曲霉特异序列的带标记引物和探针，结合PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因黑曲霉的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高转基因黑曲霉的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。本检测试剂盒使用方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，可用于快速检测转基因黑曲霉。
1.两套用于转基因黑曲霉检测的特异性引物和探针，其特征在于，序列为：xa0上游引物1：TraG-F-bio：5’biotin-GGTGAAGTTGACGCATCTCC-3’xa0下游引物1：TraG-R：5’-CCAAGAGTGTTGTATTGCTG-3’xa0探针1：TraG-P-fixa0tc：5’fixa0tc-AGATAGGCAGAATGGGTC-3’xa0上游引物2：TraP-F-bio：5’biotin-AAACGGCACAACAGGACT-3’xa0下游引物2：TraP-R：5’-CACGGTTCGGAATGTATG-3’xa0探针2：TraP-P-fitc：5’fitc-AACCTACCTCACCAAGCA-3’xa0。
2.一种用于检测转基因黑曲霉的试剂盒其特征在于，包括如下成分：xa0(1)阳性对照转基因黑曲霉DNA模板和阴性对照野生型黑曲霉DNA模板xa0(2)转基因黑曲霉TraG、TraP上下游特异引物和探针xa0上游引物1：TraG-F-bio：5’biotin-GGTGAAGTTGACGCATCTCC-3’xa0下游引物1：TraG-R：5’-CCAAGAGTGTTGTATTGCTG-3’xa0探针1：TraG-P-fitc：5’fitc-AGATAGGCAGAATGGGTC-3’xa0上游引物2：TraP-F-bio：5’biotin-AAACGGCACAACAGGACT-3’xa0下游引物2：TraP-R：5’-CACGGTTCGGAATGTATG-3’xa0探针2：TraP-P-fitc：5’fitc-AACCTACCTCACCAAGCA-3’xa0(3)10×Taqxa0PCRxa0Buffer，ddH20，2.5mMxa0dNTP，5U/μlxa0Taq酶xa0(4)生物素(Biotin)、荧光素(Fitc)抗原标记的薄膜层析试纸条。xa0
3.一种转基因黑曲霉的快速检测方法，包括如下步骤：xa0(1)PCR反应体系：xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>PCR反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。xa0(2)探针杂交：扩增结束后，加入探针(10μmol/L)2μl，94℃变性30s，53℃退火30s。xa0(3)判定结果：用TraG、TraP两套特异引物探针进行扩增、杂交，PCR产物用试纸条检测，两套引物、探针控制线正常，检测线都呈现阳性时，则说明该样品含有转基因黑曲霉，若有一套或两套引物、探针试纸条检测结果显示为阴性，则判定样品中没有转基因黑曲霉。xa0技术领域
本发明涉及转基因微生物检测技术领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条技术相结合的快速检测转基因黑曲霉的试剂盒，适用于转基因黑曲霉的快速检测。xa0
背景技术
黑曲霉(Aspergillusxa0niger)，属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属，是真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是一种非常重要的工业用菌种。xa0随着黑曲霉菌株全基因组的破译，将功能基因定向转入受体菌株的技术也越来越成熟，应用也越来越广泛，目前在酶制剂产品中的转基因微生物检测的技术还是主要依靠传统分离培养的形态学检测方法，检测灵敏度低，通常需要几天时间。近些年来，随着分子生物学和生物技术的快速发展，PCR技术成了快速检测的常用手段。但是扩增产物需要凝胶电泳，紫外凝胶成像，步骤多，耗时长，而且存在EB染色剂污染的问题。xa0本研究通过巧妙地设计针对转基因黑曲霉的带标记的特异性引物和探针，应用PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因黑曲霉的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高转基因黑曲霉检测的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。xa0
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于检测转基因黑曲霉的两套特异性引物和探针。xa0本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的核酸试纸条检测试剂盒。xa0本发明用于检测转基因黑曲霉的两套PCR引物及探针序列为：xa0上游引物1：TraG-F-bio：5’biotin-GGTGAAGTTGACGCATCTCC-3’xa0下游引物1：TraG-R：5’-CCAAGAGTGTTGTATTGCTG-3’xa0探针1：TraG-P-fitc：5’fitc-AGATAGGCAGAATGGGTC-3’xa0上游引物2：Trap-F-bio：5’biotin-AAACGGCACAACAGGACT-3’xa0下游引物2：Trap-R：5’-CACGGTTCGGAATGTATG-3’xa0探针2：Trap-P-fitc：5’fitc-AACCTACCTCACCAAGCA-3’xa0本发明的转基因黑曲霉检测试剂盒，包括以下成分：xa0(1)转基因黑曲霉DNA模板和阴性对照野生型黑曲霉DNA模板xa0(2)转基因黑曲霉带标记的上、下游引物和探针xa0上游引物1：TraG-F-bio：5’biotin-GGTGAAGTTGACGCATCTCC-3’xa0下游引物1：TraG-R：5’-CCAAGAGTGTTGTATTGCTG-3’xa0探针1：TraG-P-fitc：5’fitc-GACCCATTCTGCCTATCT-3’xa0上游引物2：TraP-F-bio：5’biotin-AAACGGCACAACAGGACT-3’xa0下游引物2：Trap-R：5’-CACGGTTCGGAATGTATG-3’xa0探针2：TraP-P-fitc：5’fitc-AACCTACCTCACCAAGCA-3’xa0(3)10×Taqxa0PCRxa0Buffer，DDH₂O，2.5mMxa0dNTP，5U/μlxa0Taq酶xa0分别用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增，PCR产物用试纸条检测，两套引物探针的检测结果显示控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因黑曲霉，若呈现阴性，则说明该样品中不含有转基因黑曲霉。xa0与现有技术相比，本发明的进步在于：使用仪器简单，无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而避免了溴化乙锭的污染，检测速度明显优于凝胶电泳成像，而且该检测方法特异性强，灵敏度高，稳定性好。xa0
附图说明
图1为TraG试纸条特异性检测，图2为TraP试纸条特异性检测，1为DDH₂O，2、3、4、5、6、7为野生型黑曲霉，8为转基因黑曲霉，从图1、图2可以看出使用本试剂盒能准确地检测出转基因黑曲霉。xa0具体实施方式第一套TraG特异引物、探针设计：xa01xa0xa0xa0xa0GGTGAAGTTGxa0ACGCATCTCCxa0TTGCCAGAGCxa0ATGGCTTGTCxa0CCTCTGGCTTxa0ATGGAGCGAGxa061xa0xa0xa0CCAGTCACTCxa0TTATCCACCAxa0CTGCCCCTTCxa0GCAGCCGCAGxa0TTTACCATTCxa0CTGCTTCCGCxa0121xa0xa0AGATGTCGGTxa0GCGCAGCTGAxa0TTGCCAACATxa0CGATGATCCTxa0CAGGCTGCCGxa0ACGCGCAGTCxa0181xa0xa0GGTTTGTCCGxa0GGCTACAAGGxa0CTTCAAAAGTxa0GCAGCACAATxa0TCACGTGGATxa0TCACTGCCAGxa0241xa0xa0TCTTCAGCTCxa0GCGGGCAGGCxa0CATGTAACGTxa0ATACGGCACAxa0GATGTTGAGTxa0CCTTGACACTxa0301xa0xa0GTCTGTGGAGxa0TACCAGGATTxa0CGGATCGACTxa0GAATATTCAGxa0ATTCTCCCCAxa0CTCATGTTGAxa0361xa0xa0CTCCACAAACxa0GCTTCTTGGTxa0ACTTTCTTTCxa0GGAAAACCTGxa0GTCCCCAGACxa0CCAAGGCTTCxa0421xa0xa0CCTCAATGCAxa0TCTGTATCCCxa0AGAGCGACCTxa0TTTTGTGTCAxa0TGATCAAATGxa0AGCCGTCGTTxa0481xa0xa0CAATTTCAAGxa0GTGATCCGAAxa0AGGCTACAGGxa0CGACGCGCTTxa0TTCAGTACAGxa0AAGGCACTGTxa0541xa0xa0GCTCGTATATxa0GAGAATCAGTxa0TCATCGAATTxa0TGTGACCGCGxa0CTCCCTGAAGxa0AATATAACTTxa0601xa0xa0GTATGGCCTTxa0GGGGAGCATAxa0TCACGCAATTxa0CCGCCTCCAGxa0AGAAATGCTAxa0ATCTGACCATxa0661xa0xa0ATATCCTTCGxa0GATGATGGAAxa0CACCTATTGAxa0CCAGTGAGTAxa0CTGATATCCCxa0GCCCGTATCTxa0721xa0xa0TCTGGTTCTAxa0CTCTTGAAACxa0TTACTCGTCCxa0TAGAAACCTCxa0TACGGCCAACxa0ATCCCTTCTAxa0781xa0xa0TCTGGATACAxa0AGATATTACAxa0AAGGAGATAGxa0GCAGAATGGGxa0TCTTATATTCxa0CCGTCAAAAGxa0841xa0xa0CAGCGAGGCTxa0GATGCCTCGCxa0AAGATTATATxa0CTCCCTCTCTxa0CATGGCGTGTxa0TTCTGAGGAAxa0901xa0xa0CTCTCATGGAxa0CTTGAGATACxa0TCCTCCGGTCxa0TCAAAAATTGxa0ATCTGGCGGAxa0CCCTAGGTGGxa0961xa0xa0AGGAATCGATxa0CTCACCTTCTxa0ACTCAGGCCCxa0CGCCCCGGCCxa0GATGTTACCAxa0GGCAATATCTxa01021xa0TACCAGCACTxa0GTGGGATTACxa0CGGCCATGCAxa0GCAATACAACxa0ACTCTTGG第二套Trap引物探针设计：xa01xa0xa0xa0xa0AAACGGCACAxa0ACAGGACTACxa0CATTAGGCGTxa0GCCCCCGAACxa0CGATTCCTCCxa0CATCACAACCxa061xa0xa0xa0CACACTCCCGxa0CCGTTCACAAxa0TATCATTCAAxa0CGCACCCTTCxa0TCACTTCCGAxa0CACCATACAGxa0121xa0xa0GAACGGATTCxa0AAGAACCCCAxa0TCACAGGCAAxa0CCCGGCCCTCxa0AGTCTCGCATxa0CGTTCAACAAxa0181xa0xa0CGCGATGACGxa0CCACTGAACGxa0TCGGCGCGGAxa0GCAACTCGTCxa0CCGTCGAACTxa0GGCCAAGCATxa0241xa0xa0GCCCTTGTCGxa0TAAACAGCGTxa0AGTTGACGCCxa0CTGCGCGGAGxa0ACGTCGGGGAxa0AGGCGCGGCCxa0301xa0xa0GGAGGCGTTGxa0AAAAGCCCCGxa0AGAACTTGTTxa0GCCCAGGTGCxa0TTGGTGAGGTxa0AGGTTTGCACxa0361xa0xa0GGCGGCGTGTxa0TGGTAGGAGGxa0GGCGGGGCCAxa0GAGGTCGGAGxa0AAGCCGCCGGxa0AGGAGAAGGAxa0421xa0xa0GACGGCTTGCxa0TCGGGGGAAGxa0TCTTGGAGGTxa0TGCGCCGACGxa0GAGGTTACCCxa0AGGGGCAGGAxa0481xa0xa0GGCGGGGAATxa0TGAGGAGGGAxa0AGTGCGTGCGxa0GTTGGTGCCGxa0TCGTTGGTGAxa0GGCAGGCGGCxa0541xa0xa0GCCGACGCCGxa0GAGTCGCCGCxa0TGGAGAAGATxa0TACAGAGACGxa0CCGCGGCTGCxa0CGAGTTGGGCxa0601xa0xa0GTAGAGGTTGxa0CAGACGGTGCxa0GGGCGTAGGGxa0GACGGGGATAxa0GTCTGTTGGTxa0GTTGTTAGTTxa0661xa0xa0TGGTTGAGAGxa0AGGTGAGGGAxa0TGTAAAATGGxa0AATGGGTCAGxa0GTGAGGTGCAxa0TACCTGTTCGxa0721xa0xa0TCTTCACCGTxa0AGGAGGTAGAxa0GATGACTTGTxa0GGGAGGTCGGxa0AGTTGTTAAGxa0CTTGAGGATTxa0781xa0xa0CCCTGAAGGAxa0AGTCAAGGTAxa0GGGCTCGTTGxa0CTGTTGTCGTxa0TGGGGTCGGGxa0GGAGCTCAGGxa0841xa0xa0TCGGGGACTAxa0GTTCGCCGCGxa0TCCGCCGGTGxa0CTGTACTCGGxa0TGATGGGGACxa0GGGAGCGCTGxa0901xa0xa0ACGCCCAGGAxa0TGTACTGCAGxa0GTCGAGGTTGxa0GCTTCGCCGCxa0TGTCACTCGAxa0TGAAAGCTGAxa0961xa0xa0TCGTTGAGGCxa0CGCCGTTGAAxa0TTGGACGACGxa0CTGAAGTTCTxa0GGCCGATGGCxa0ATTGGGAGCCxa01021xa0AGGTGCTGCTxa0CGAACCTCTCxa0GAGCTAACATxa0ACATTCCGAAxa0CCGTG根据转基因黑曲霉的重组DNA序列，利用引物设计软件设计两组引物、探针(下划线位置)，上游引物5’标记生物素(biotin)，探针3’标记荧光素(fitc)，引物。xa0上游引物1：TraG-F-bio：5’biotin-GGTGAAGTTGACGCATCTCC-3’xa0下游引物1：TraG-R：5’-CCAAGAGTGTTGTATTGCTG-3’xa0探针1：TraG-P-fitc：5’fitc-GACCCATTCTGCCTATCT-3’xa0上游引物2：Trap-F-bio：5’biotin-AAACGGCACAACAGGACT-3’xa0下游引物2：Trap-R：5’-CACGGTTCGGAATGTATG-3’xa0探针2：Trap-P-fitc：5’fitc-AACCTACCTCACCAAGCA-3’xa0标本来源xa0本实验测试了来源不同的7种黑曲霉，其中包括6种野生型黑曲霉，1种转基因黑曲霉，见下表：xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例1、转基因黑曲霉的检测xa0DNA提取：采用Qiagenxa0DNeasyxa0plantxa0minixa0kit试剂盒，按步骤提取取真菌基因组DNA溶于100uLxa0TE中，-20℃保存备用。xa0PCR扩增：分别以ddH₂O、A.nig1、A.nig2、A.nig3、A.nig4、A.nig5、A.nig6和NZ-A.nig基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。xa0PCR反应体系：xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>PCR反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。xa0探针杂交：扩增结束后，加入探针(10μmol/L)1μl，94℃变性30s，53℃退火30s。xa0试纸条检测：分别取4μL扩增、杂交产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加2-3滴缓冲液，5min后判读并记录结果，结果如图1、图2，1：ddH20；2：A.nig1；3：A.nig2；4：A.nig3；5：A.nig4；6：A.nig5；7：A.nig6；8：NZ-A.nig。xa0结果表明，图1、图2的8号转基因黑曲霉在检测线出现特异性红色条带，其余水及其他各阴性对照黑曲霉均无条带出现，只有两套引物、探针检测线同时显示特异性条带时，表明检测物中含有转基因黑曲霉成分。xa0序列表ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="522"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>xa0